十分钟教会你：如何搞定蛋白定点缺失突变

Hello同学们，大师兄来继续更新这个系列啦——引物设计，过去我会自己手动设计，不过现在这个时代，大脑辅助软件，按照难易程度和实际应用情况，我决定按照以下顺序为大家讲解，后面就跟着我一起来学习吧，希望能帮助到你：

引物设计初级篇（一）之原理+注意事项

引物设计初级篇（二）之选择（无缝克隆）同源重组or酶切酶连？

引物设计初级篇（三）酶切酶连引物设计及实操教学

引物设计初级篇（四）同源重组引物设计及实操教学

引物设计初级篇（五）如何找到paper里验证过的引物序列

引物设计中级篇（一）多片段+长片段克隆引物设计及实操

引物设计中级篇（二）之qPCR 如何选对引物？

引物设计中级篇（三）之CRISPR gRNA表达载体引物设计

引物设计高级篇（一）点突变如何设计引物

引物设计高级篇（二）缺失突变如何设计引物

引物设计高级篇（三）插入突变如何设计引物

引物设计高级篇（四）小心移码突变等一些注意事项

根据讲解情况和大家反映的问题，可能会增加或更改相应的内容

在课题研究中，我们会涉及如下的问题：

● 某个基因是否真的参与了某条信号通路？

● 某一段结构域在蛋白功能中到底起什么作用？

这时候，功能验证就显得尤为关键。构建缺失突变是一种非常高效的策略，即通过针对性地删除基因中的特定片段，验证其对蛋白功能、定位或相互作用的影响。所以大师兄这一期就为大家来讲解一下如何简单快速地构建完一段序列的缺失？

缺失突变实际上就是点突变的延伸版，将同源重组技术与反向PCR结合，我们在引物的 5' 端添加一段 15-20 bp 的同源序列，使扩增产物两端具有互补的同源臂。

在反向PCR过程中，以目标质粒为模板，利用背向引物扩增得到缺失目标片段的线性化全长质粒。随后，依赖大肠杆菌体内的重组或修复机制，使线性DNA分子发生同源重组并重新环化，从而获得目标缺失突变质粒，整个过程实际上非常简单。

图片引自 https://www.takarabio.com/

我依然以GLUT1这个蛋白为例，手把手教大家构建，话不多说直接开始！

我们在设计一段缺失时，首先一定要根据文献去查询蛋白的结构域及其功能，只有这样缺失设计才具有明确的生物学意义，而不是随便删一段。

比如说GLUT1这个跨膜蛋白，文献表明，其胞内螺旋结构域（intracellular helical domain, ICH）这个这个结构域在 GLUT1 底物转运构象变化中起着重要的铰链作用。基于此，我选择在GLUT1 CDS中删除ICH区域内一段高度保守序列，长度为30 bp（对应10个氨基酸：Glu-Glu-Ser-Arg-Gln-Met-Met-Arg-Glu-Lys）

p.s.切记如果质粒是带tag标签的或下游存在融合蛋白要避免移码产生的提前终止，设计时需要精确计算缺失碱基数为3的倍数！！

现在很多生物试剂公司官网都有免费的同源重组引物设计工具，只需输入载体序列和目标片段序列，比如进入网站：

https://tool.vazyme.com:18002/cetool/singlepoint.html

在单点突变这个界面里，我们需要输入突变位点上游序列和下游序列至少50bp，因为是缺失突变，所以中间的框框是不用填的，打开Snapgene复制序列，填入到界面里，点击生成引物：

以野生型环状质粒为模板，F 引物的 3' 端（后 24 bp）会特异性地结合在 30bp 缺失段的下游，它的 5' 端（前面的 9 bp）因为没有互补序列而暂时悬空。聚合酶从 F 引物开始绕着整个质粒复制一圈；R 引物的 3' 端（后 24 bp）会特异性地结合在 30bp 缺失段的上游，同样 5' 端部分悬空。聚合酶从 R 引物开始，反向绕着整个质粒复制一圈。

从第二轮开始，悬空的 5' 端也会被补齐，最终扩增出来的双链线性 DNA的左右两端，各自带着18 bp 的同源序列。线性产物转化到大肠杆菌里后，菌体内源的同源重组修复系统会识别这两个末端的互补序列，催化它们进行同源重组，线性DNA就变成了一个完整的环状质粒，从而实现了片段的定点删除。

Step 1: 反向PCR 扩增

反应体系（以 Vazyme Phanta Max 单酶体系为例）

Step 2: 电泳检测

在进行下一步消化前，先跑胶确认PCR 是否成功扩增出了预期的线性条带。

① 取 5 μL PCR 产物，与 Loading Buffer 混匀。

② 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳。

Step 3: DpnI 消化去除模板质粒

DpnI 只切割带有甲基化的模板质粒，对 PCR 扩增出的线性产物无影响。确认电泳有目标条带后，直接向剩余的 45 μL PCR 原液中加入 1.0 μL DpnI。置于 PCR 仪或水浴锅中，37°C 孵育 1- 2 小时。

后续就是取10 μl 产物加入到100 μl感受态细胞中，转化摇菌挑单克隆就好了，在往期都要详细介绍，这里就不赘述了。

好了，这期推文就更新到这里，学到这里我相信你已经知道文章里常出现的蛋白N端或者C端截短突变怎么做了，希望各位同学可以举一反三哈！如果你觉得这篇内容有用，欢迎点赞、转发、收藏，也欢迎在评论区继续讨论。引物系列专题课程下一期不见不散！