【作 者】刘容枝
国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心 北京市100044
【摘 要】结核分枝杆菌抗体检测试剂是结核病辅助诊断的重要手段之一，其检测的准确性至关重要。该文就结核分枝杆菌抗体检测试剂注册申报的三项重要的技术资料（主要原材料研究资料、分析性能评估资料和临床试验资料）中的重点问题进行探讨，以供申报者参考。
【关键词】结核杆菌抗体检测试剂；主要原材料研究资料；分析性能评估资料；临床试验资料
结核病是影响人类健康的主要传染病之一，特别是在发展中国家，其发病率和死亡率一直居高不下。据报告，我国现有结核病患者约450万例，每年死亡近13万例。结核病的实验室诊断主要依赖痰涂片抗酸染色和培养法，结核血清学检测试剂和核酸检测试剂是结核病辅助诊断的重要手段。结核分枝杆菌抗体检测是结核血清学检测中非常重要的组成部分，可提高涂片阴性结核病的检出率以及进行鉴别诊断，因此，其检测的准确性（敏感性和特异性）至关重要。
结核分枝杆菌抗体检测试剂是指利用免疫学方法（如：酶免疫技术和胶体金等分析技术），对人体血清或血浆等样本中的结核分枝杆菌抗体进行体外定性检测的试剂，可用于结核病的辅助诊断。结核分枝杆菌抗体检测试剂，主要指结核分枝杆菌IgG和IgM抗体检测试剂。目前，国家食品药品监督管理总局批准的结核分枝杆菌抗体检测试剂主要为IgG或IgM定性检测试剂。
主要原材料选择的合理与否，直接关系到申报试剂的性能。因此，申请人应对市场进行充分调研后进行严格筛选，通过试验验证、选出适合自己研发平台的原材料。对于结核分枝杆菌抗体检测试剂而言，最重要的主要原材料是抗原。
抗原的制备主要包括两种方式：一种是从病原体中提取目标抗原；一种是采用基因工程技术制备重组抗原。随着分子生物学技术的日趋成熟，基因工程抗原的获取越来越方便，成本也越来越低；而且，与传统的病原体制备而来的抗原相比，基因工程抗原的纯度相对较高、抗原表位和片段大小的选择也相对灵活。对于酶标板等抗原包被表面积较小的固相载体而言，抗原越小，意味着可包被的有效抗原表位的绝对数量越多，试剂的灵敏度会提高。而且，许多生产厂家自身就具备生产基因工程重组抗原的技术平台。因此，近些年来，基因工程重组抗原颇受体外诊断试剂生产厂家的青睐。
但是，大部分的基因工程重组抗原来源于大肠杆菌原核表达系统，缺少糖基化等真核细胞中特有的蛋白后修饰过程，因此，与寄生在人体细胞中的、采用人体细胞真核表达系统进行蛋白表达修饰的结核分枝杆菌抗原相比，存在一定的差异。另外，大肠杆菌表达系统除了产生目标抗原外，还包括许多自身的其他蛋白，尽管经过多种方法分离纯化后，得到的目标抗原的纯度较高，生产厂家仍需要考虑大肠杆菌表达系统可能引入的非特异性反应。因此，申请人需广泛选择抗原，并采用临床血清或血浆样本进行试验，筛选与真实的临床样本反应性且特异性好的抗原。
一般采用企业参考品来筛选抗原。企业参考品的制备，则常采用已上市的至少2家同类试剂检测临床血清或血浆样本，选择几种试剂同时检测为阴性或阳性的临床血清或血浆样本，作为企业阴性参考品或阳性参考品。阳性参考品应包括临界阳性样本、中等浓度阳性样本以及高浓度阳性样本，覆盖临床可能出现的各种程度的样本，便于选出具有高灵敏度的抗原；同时，阴性参考品应包括可能产生交叉反应的其他病原体抗体阳性的血清或血浆样本，便于选出具有高特异性的抗原。除此之外，还需选择合适抗体滴度的临床阳性样本作为精密度参考品，以便考核备选抗原的稳定性。
申请人在提交此部分资料时，需详细描述抗原选择过程的各种研究资料以及验证资料。
已获批准的结核分枝杆菌抗体检测试剂均为定性检测试剂，目前尚无结核分枝杆菌抗体定量检测试剂获准上市。因此，对于该类试剂的最低检出限，无法给出绝对浓度。为了确定该类试剂的最低检出限，一般选取经其他已上市的同类试剂确认为阳性的、特定滴度的结核分枝杆菌抗体样本，做系列倍比稀释后进行检测，将检测结果阳性率在90%以上（n ≥20）的最大稀释倍数作为申报试剂的最低检出限。
影响申报试剂特异性的因素主要包括：抗原结构相近或临床症状相似的其他病原体的抗体可能带来的交叉反应；以及临床样本本身含有的干扰物质和抗凝剂（血浆）可能带来的干扰。
研究抗原结构相近或临床症状相似的其他病原体的抗体对结核分枝杆菌抗体检测试剂是否存在交叉反应。用于交叉反应研究的其他病原体包括但不限于：弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、肺炎支原体、人类免疫缺陷病毒、肺炎链球菌等。一般采用已经上市的试剂筛选其他病原体抗体阳性、而结核分枝杆菌抗体阴性的临床样本，然后采用申报试剂检测这些临床样本，如申报试剂的检测结果为阴性，说明其他病原体的抗体对申报试剂无交叉。
申请人需提交用于交叉反应验证的病原体的来源、浓度或滴度确认等信息。
（1）内源性物质的干扰
需研究样本中常见的内源性干扰物质（总IgG、总IgM、胆红素、血红蛋白、甘油三酯、系统性红斑狼疮、抗核抗体、类风湿因子等）对结核分枝杆菌抗体检测试剂的干扰情况。常用方法为：采用申报试剂检测结核分枝杆菌抗体阴性的、含有不同浓度干扰物质的临床样本，以及结核分枝杆菌抗体弱阳性的（临界浓度）、含有不同浓度干扰物质的临床样本，研究不同浓度的干扰物质对申报试剂检测结果的影响，确定不影响检测结果的干扰物质的最高浓度。
（2）抗凝剂的干扰
如果结核分枝杆菌抗体检测试剂可用于血浆样本的检测，需采用各种适用抗凝剂抗凝的血浆样本分别与血清样本进行比对实验研究。常用方法为：检测至少50例同源的结核分枝杆菌抗体阴性、弱阳性（略高于临界值）的血清和血浆样本（不同抗凝剂各50例），并计算阴性符合率和阳性符合率，进行定性试剂的统计分析，验证申报试剂对于血清和血浆样本检测结果的一致性。
对于结核分枝杆菌IgM抗体检测试剂而言，还需对至少10份含有结核分枝杆菌IgM抗体的样本进行IgM破坏研究实验。常用方法为：采用特定的化学制剂（如2-巯基乙醇或二硫苏糖醇）处理含有结核分枝杆菌IgM抗体的临床样本，破坏结核分枝杆菌IgM抗体的结构后，重新进行检测，申报试剂的检测结果应为阴性。
精密度试验无约定方法，申请人可根据自身的研发平台确定科学合理的方法。申请人可参考国内或国外的相关文件进行精密度研究。需对每项精密度指标的评价标准做出合理的要求，如标准差或变异系数的范围等。结核分枝杆菌抗体的精密度评价主要包括以下要求。
（1）验证申报试剂检测过程中的主要变量（如：申报试剂本身、配套的适用机型、操作者、地点等要素）对精密度的影响。
（2）设定合理的周期进行精密度评价。例如：进行至少20d的检测，每天至少由3人完成不少于3次的检测，以便对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行评价。
（3）采用至少以下3个水平的临床样本进行精密度的评价：阴性样本：结核分枝杆菌抗体浓度低于申报试剂临界值的临床样本；弱阳性样本：结核分枝杆菌抗体浓度略高于申报试剂临界值的临床样本；阳性样本：结核分枝杆菌抗体浓度呈中到强阳性的临床样本。
对于采用一步法免疫学原理的结核分枝杆菌抗体试剂（比如胶体金法等），还需研究申报试剂对含有高浓度结核分枝杆菌抗体的临床样本的检测能力。常用方法为：系列稀释含有高浓度结核分枝杆菌抗体的临床样本，然后由低浓度至高浓度进行检测，每个稀释度的样本重复检测3~5次，考查申报试剂是否对高浓度阳性样本检出阴性。
应当选定不少于3家（含3家）获得国家食品药品监督管理总局资质认可的临床试验机构进行临床试验。临床试验机构必须具备与申报试剂相适应的专业技术人员及仪器设备，并且能够确保该项试验的实施。建议申请人选择结核病专科医院进行临床试验，同时考虑临床试验机构的地域性，以保证临床样本获取的充足性、临床数据的可溯性以及临床样本选取的多样性和代表性。
目前，已有多种结核分枝杆菌抗体检测试剂获准上市。申请人可选择境内已批准上市的、临床普遍认为质量较好的同类试剂作为对比试剂进行比对研究，证明申报试剂与已上市产品等效或优于已上市产品。由于不同企业的结核分枝杆菌抗体检测试剂包被的抗原可能存在较大差异，建议申请人在进行临床试验前进行预实验，以便从多种已上市试剂中选择性能相近同时质量较好的对比试剂进行临床试验。
对于结核分枝杆菌IgM抗体检测试剂而言，申请人还需采用申报试剂检测不少于30例感染急性期患者的样本。确定感染急性期的方法包括：病原体分离培养鉴定方法、病原体IgG抗体血清学转换（动态监测2份或以上的血清IgG，恢复期与急性期比较IgG呈4倍以上升高）、病原体核酸检测或直接抗原检测等方法。提醒注意的是，应密切结合患者的临床诊断综合判断病例是否处于病原体感染的急性期。
临床试验对象的选择需满足如下条件：（1）具有结核病症状/体征的疑似结核患者病例；（2）结核病的病例需包括一定数量的肺结核和肺外结核病例，并含有适当数量的涂片阴性的结核病病例，病例的选择应满足临床流行病学的分布特点；（3）应包括其他易混淆疾病的病例（比如肺癌、肺炎等），以对申报试剂的特异性进行评价。
如果申报试剂同时适用于血清和血浆两种样本类型，还应对至少200例的样本进行血清血浆样本的同源比对研究。
最终纳入统计的所有病例的临床背景信息（临床诊断、年龄、性别等）都应清晰并具有可追溯性。临床原始数据表应包括临床诊断信息，临床诊断必须是最终的临床确诊结果，而不是进行简单症状的描述。
结核病的临床确诊非常复杂，抗体检测试剂作为有力的辅助诊断手段，其检测的准确性至关重要。申请人在研发此类试剂时，在进行抗原等原材料的筛选时，就应充分考虑这些原材料对产品性能的影响（敏感性和特异性），并在分析性能评估和临床试验中对其敏感性和特异性进行充分的验证。
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